Математики и статистики, help!

Обрабатываю результаты, совершенно не соображаю, как мне посчитать достоверность хотя бы приблизительно. Случай нетривиальный, требуется помощь зала в подсчете дельтадельтаСт в qRT-PCR.
Под кат смотреть тем, кто считает себя хорошим математиком и может дать совет. Остальным будет неинтересно.

1. Итак, прибор фиксирует определенное значение. Оно означает, что в момент фикисрования значения (цикла) количество продукта в реакции удваивается. Значение называется Ст.

2. Эти значения колеблются от 18 до 30. То есть все, что я меряю, имеет значения в разумных пределах, например 20.2, 18.6, 27.1, 21.3 и так далее. Это установлено параметрами реакции. Одновременно фиксируется 200 таких значений. Одно из этих значений — контроль и равен он 21 (назовем его ген К).

3. Дальше я пляшу от этого контроля и считаю дельта Ст. Например, одно из 200сот значений, назовем его ген А 22, 5, значит 22,5- 21= 1,5

4. Поскольку продукт удваивается, то эта разница означает, что у меня исходного продукта было 2,25 раз меньше (таковы условия игры). То есть разница в дельта Ст в одну единицу означает удвоенную разницу в продукте по принципу геометрической прогрессии. Если дельта СТ равна 3, то соответственно разница в 9 и так далее.

5. Если одно из 200 значений меньше 21 (контроля), например, 20.3 (назовем его ген Б), то у меня дельтаСт имеет минусовое значение. 20.3-21=-0.7 Это для меня большого значения не имеет. Это говорит только о том, что у меня исходного продукта было в 0.49 раз больше.

6. Этот контроль ген К у меня используется исключительно для нормализации результатов. Потому что в следующем измерении я повторяю реакцию для 200 значения при новых условиях. Контроль для нормализации остается прежним. Только вышеупомянутый ген А при новых условиях показывает значение не 22.5, а скажем, 24.1. А ген Б вместо 20.3 показывает 20.0.

7. Таким образом для гена А и Б я первым делом провожу нормализацию против контроля :
Сырые данные:
Эксперимент 1
ген А 22.5
ген Б 20.3
ген К 21.0
Эксперимент 2
ген А 24.1
ген Б 20.0
ген К 21.0
Нормализованные данные (дельта Ст):
Эксперимент 1
ген А 1.5
ген Б -0.7

Эксперимент 2
ген А 3.1
ген Б -1

8. Теперь я сравниваю дельта Ст для гена А и Б в разных экспериментах. Это называется дельта-дельта Ст.
Ген А 1.5-3.1= -1.6
Ген Б -0.7 +1 = 0.3

7. Как я выше уже сказала, изменение на одну единицу обозначает разницу в исходном продукте в два раза. Разницу я считаю как
Ratio = 2^-дельта дельта Ст. Итого,

Ген А =2^-(-1.6)=3.03
Ген Б =2^-(0.3)=0.8

8. До этого момент мне все ясно. Теперь начинается статистика. Я повторяю все измерения скажем дважды. Любой биолог, скажет, что с двумя повторами никакой статистики не сделаешь. Но тут есть нюансы. Метод достаточно надежный, с внутренним контролем (ген К), довольно чувствительный и дорогой. Я посмотрела публикации и вижу, что народ умудряется публиковать вообще с одним измерением без повтором. Валидируют один раз метод и больше валидирование не повторяют. Но я повторила это все дважды. Это мало для того, чтобы делать ттест и считать Р-value.

9. Поэтому максимум считают coefficient of variation. И тут у меня полный ступор. Если считать coefficient of variation для трех сырых значений трех измерений скажем гена М, например, 22.1 22.0 22.3 то у нас получается чудесное значение CV 0.56% . А если считать coefficient of variation для дельта СТ 1.10 1 1.3, то получается уже 11% !

Еще хуже, если значения для гена С 21.1 21.0 21.3 то для сырых значений CV 0.59%, а для нормализованых против котроля значений 0.1 0 0.3 CV будет показывать безобразные 93%!!! А ведь реальная разница одна и та же.

10. Че делать?

11. UPD Я не одна такая дура и это радует.  12. UPD2.  Болельщикам и помощникам. Спасибо за ответы и советы и нужные вопросы. Я пока все еще не разобралась, как мне считать вариабельность, но наверное буду делать так, тем более есть на что ссылаться: "To analyse gene profiles between the two biological replicates, a one-way ANOVA (P < 0.05), using Statistica software (Statsoft, Tulsa, OK), was performed on each TF. In order to calculate relative TF expression levels, the efficiency values of each amplification reaction were taken into account using LinReg software.  Amplification reactions of efficiencies lower than 1.6 were considered as missing data. Differences in transcript abundance during seed developmental stages were also evaluated by a one-way ANOVA test (P < 0.05) and a Student–Newman–Keuls test for each TFs using SAS software package (SAS Institute 1999). To compare expression profiles, expression values were adjusted by a normal distribution." Осталось узнать, чем отличается one-way ANOVA от two-way ANOVA, как это все отличается от банального ттеста и что такое Student–Newman–Keuls test.

Реклама

66 Responses to Математики и статистики, help!

  1. Подпишусь на комментарии, пожалуй. Сама сейчас собираюсь делать риал-тайм, и в упор не понимаю, как там обрабатывают результаты. Именно с этого места.

  2. в. пп. 2,3 ви рахуєте Delta^2, а повинні 2^Delta

  3. а что нужно? показать, что результаты для А и Б отличаются от К статистически-значимо (significantly)?

  4. Нет. То есть не совсем.
    То есть давайте на конкретном примере.
    Эксперимент 1 (два повтора)
    ген А 22.5 22.3 reproducible?
    ген Б 20.3 20.1 reproducible?
    ген К 21.0 21.0
    Эксперимент 2 (два повтора)
    ген А 24.1 24.3 reproducible?
    ген Б 20.0 20.2 reproducible?
    ген К 21.0 21.0
    И!
    Ген А эксп1 vs эксп2 significant?
    Ген Б эксп1 vs эксп2 significant?

  5. Так. Але це виключно для демонстрації суті значення.

  6. Понимаю! У меня уже дым коромыслом над головой.

  7. не математик но скажу 🙂
    1. почему Вы везде используете основание 2? У Вас реакция всегда идет с 100% эффективностью?
    2. Сейчас сильно не рекомендуют использовать только один референтный ген
    3. Видел недавно в пнасе значения дельтадельтацт типа 400+/-300. А вообще, говорят, что 20-30% — это нормальная ошибка

  8. такой безобразный коэффициент вариации на нормированных значениях у Вас получается потому, что Вы сравниваете этим подсчётом не отличие абсолютных, изначальных величин, а уже саму дельту. Естественно, она получается огромной.
    Вам нужно взять некоторую допустимую погрешность альфа и проверить одной из формул, выполняется ли некоторое правило («Верно ли, что вариативность гена А не превышает 0.1%?») и рассчитав по имеющимся у Вас данным, сказать, что «Да, это верно с вероятностью 99.995 %» /если погрешность взята за 0.005/

  9. Re: не математик но скажу 🙂
    1. почему Вы везде используете основание 2? У Вас реакция всегда идет с 100% эффективностью?
    Я расчитываю эффективность для каждого конкретного гена отдельно. Но в данном случае это не меняет постановку вопроса. Мне там все ясно, а математиков запутаю.
    2. Сейчас сильно не рекомендуют использовать только один референтный ген
    Я использую 5 референтных генов, которые отдельно подыскивала, базируясь на статьях и результатах micro macro arrays, чтобы были developmental independent. И это не считая всяких контролев контаминации и эффективности обратной транскрипции. Но это тоже не имеет отношение к вопросу.
    3. Видел недавно в пнасе значения дельтадельтацт типа 400+/-300. А вообще, говорят, что 20-30% — это нормальная ошибка
    Понимаю! Но не понимаю от чего эту ошибку считать? У меня в данном случае пять референтрых генов на large scale qRT-RCR и там такой разброс значений Ст, что я уже не соображаю от чего считать.

  10. постою, послушаю…

  11. Ну, я хорошим математиком себя не считаю… Но что-то умное сказать попробую. Сначала уточняющие вопросы:
    1. А как делают статистику в тех статьях, которые ты видела, и где используют два измерения? Что там меряют — коэффициент вариации, или что ещё?
    2. Непараметрические критерии применять пробовала? Или это нельзя по условиям задачи?

  12. Я это понимаю. Я пробую сообразить, есть ли какая-то возможность абсолютные значения релятивировать так, чтобы все 200 генов имели значения в одной величине. Особенность именно этой платформы заключается в том, что она не работает с абсолютными величинами. Они не имеют значения.

  13. погуглите на «проверка гипотезы о значимости дисперсии».
    если я правильно понимаю Вашу задачу, и вам нужно подтвердить некоторое утверждение касательно дисперсии некоторой величины (предположительно нормально распределенной)

  14. 1. Here, we wanted to determine the variation between different biological replicates which encompasses both technical and biological variation. Using cDNA synthesised from DR2 harvested in three independent experiments we measured the expression of 201 TF genes. (Это при том, что их платформа содержит 2500 генов. Похоже это пилотная проверка) The ΔCT (CT_gene of interest — CT_reference gene) was calculated and the precision of the assay was assessed using the coefficient of variation (CV). Despite the fact that the majority of gene models tested (111 genes) displayed an extremely low expression level (CT > 35), the obtained mean CV was 14%. This is in good agreement with published expression data for human keratinocyte subclones, in which a CV of 18% was found for genes with a CT > 30.
    И это все! Больше ничего там нетути. Нам, гагарам, совершенно непонятно, как это им так удалось посчитать. Допустим, все эти гены имели приблизительно одинаковый Ст в пределах 35ти, тогда понятно. А если одни 35, а другие 28, а контроль 21, тогда будет туфта.
    http://www.plantmethods.com/content/3/1/7 «A quantitative RT-PCR platform for high-throughput expression profiling of 2500 rice transcription factors»
    2. Что такое непараметрические критерии? Я вот интуитивно ощущаю, что 22.5 и повтор 22.3 это ок, а 22.5 и повтор 21 это не ок.

  15. Re: не математик но скажу 🙂
    Все, понял. Я делаю так: высчитываю конечную дельту и стандартное отклонение. Вернее, это делает програмное обеспечение CFX96 ))) Хотя, конечно, при малой выборке это наверное не совсем корректно.

  16. погуглите на «проверка гипотезы о значимости дисперсии».
    если я правильно понимаю Вашу задачу, и вам нужно подтвердить некоторое утверждение касательно дисперсии некоторой величины (предположительно нормально распределенной)

  17. охотно погуглю. надеюсь, что соображу. Спасибо!

  18. Я, конечно, не гинеколог…
    «Слова Ваши смутны как сон верблюда».*
    Если хотите, пришлите данные на oleg.talibov@gmail.com , я попробую чем-нибудь помочь (до конца недели).
    ______
    * — одна из гневных филиппик акад. Багбанлы (Войскунский и Лукодьянов «Экипаж Меконга»).

  19. Re: не математик но скажу 🙂
    Если я тестирую экспрессию пяти генов в трех линиях, то я могу позволить себе повторов для любой статистики. А когда у меня платформа на 200 генов и я тестирую 5 линий, а каждой по 5 стадий развития и к каждой дикий тип для контроля, то получается столько runs, что рухнет институтский бюджет.

  20. Re: Я, конечно, не гинеколог…
    Спасибо! Я еще помучаюсь, если не вырожу ничего, то обращусь!

  21. Re: Я, конечно, не гинеколог…
    Если выродите, дайте знать. Я в последние два месяца, похоже, стремительно меняю основную специальность.

  22. Re: не математик но скажу 🙂
    Ну, тогда повторов лучше совсем не делать — будет больше похоже на чип! Но, если серьезно — даже не знаю, что в таком случае можно посоветовать

  23. Re: не математик но скажу 🙂
    Ха! Я чипы уже повторяю по три раза! Сейчас редкий чип можно продать в журнал без соответствующей статистики.

  24. Точно скажу, что нельзя coefficient of variation считать для итогового значения. Просто потому что микроскопическая разница в первичных данных даст огромный разброс в конечном значении. Правда, больше ничего точно не скажу..

  25. дуже якось розмито літерами 🙂

  26. осмелюсь попросить: когда будет найден подходящий путь решения, напишите, что именно это был за путь /хотя бы в общих чертах/, а то магистр прикладной математики в моей душе очень интересуется 🙂

  27. Напишу обязательно. Сейчас штудирую статьи на эту тему. Как-то все элегантно обходят статистические рифы, стыдливо рисуют скаттер-плот двух биологических повторов и считают correlation coefficient (Rквадрат)

  28. Я сейчас склоняюсь к мысли, что
    1. расчитываю допустимую погрешность метода для контроля, который у меня на самом деле тоже вариирует (значение из примера ген К 21 это оптимальное значение, но на самом деле оно колеблется от 20,9 до 21,3), но контроль повторяется в большом количестве экспериментов и значений достаточно для надежной статистики).
    Допустим, что вариативность гена К не превышает 0.1% во всех экспериментах. Беру это утверждение для остальных генов.
    2. Исходя из этого заявляю, что если в двух повторах для гена А вариативность лежит за этими рамками, значит он не reproducible и фильтруется из дальнейших расчетов. Если лежит в рамках, то считаю для двух измерений среднестатистическое и сравниваю средние значения для гена А в двух (на самом деле в пяти) экспериментах. Если вижу разницу больше, чем в полтора раза, то считаю ее как significant.

  29. Непараметрические критерии — критерии сравнения для величин, которые распределение которых необязательно нормальное. Их много таких: критерий хи-квадрат, Уилкоксона, Манна-Уитни, и т.п. Перечень вот тут: http://en.wikipedia.org/wiki/Non-parametric_statistics#Methods , описания по ссылкам достаточно хороши. И вообще, погляди статью полностью — хорошо написано, думаю что пригодится. Насколько я понимаю, у тебя проблема именно в том, что выборка маленькая, и о нормальности распределения говорить нельзя. Отсюда и все беды. Соответственно, думаю, стоит попробовать подобрать непараметрический критерий сравнения из списка по ссылке. Насколько понимаю, у тебя равные количества контрольных и исследуемых проб, потому я бы, для начала, рассмотрел U-критерий Манна-Уитни http://en.wikipedia.org/wiki/Mann-Whitney_U .
    Если же ты хочешь непременно чтобы как в процитированном, с коэффициентом вариации, то моё мнение совпадает с этим:
    http://progenes.livejournal.com/52849.html?thread=1460337#t1460337
    http://progenes.livejournal.com/52849.html?thread=1464689#t1464689

  30. Анонімний:

    Скажите, а вас не смущает то, что «цена деления» (или разрешение) равно двум?
    Т.е. нельзя увидеть менее чем двухкратное различие.
    Ещё такой маленький вопросик — а эффективность амплификации референсов и таргетов однакова? Проверяли? 🙂
    А в литературе приходилось такое встречать?
    Vlad

  31. 1. я подумаю над этим. Меня смущает, но мне непонятно, почему в статьях лихо показывают Ст до третьего знака после запятой. Хотя я поняла основную мысль.
    2. Разная. Я подсчитала эффективность амплификации с помощью linReg. Она у меня колеблется от 1.7 до 2.0. Все, что за рамками, фильтруется. Я сравнивала конечные результаты Ratio = 2^-дельта дельта Ст и
    Ratio =(E target)^delta Ct target (Exp1-Exp2)/(E refer)^delta Ct refer(Exp1-Exp2)
    Различия в абсолютных значениях есть, но они не существенные. У меня одна и та же проблема, как расчитывать достоверность в биологических повторах. Ст? дельта Ст? дельтадельтаСт? В разных источниках по разному.

  32. ja dolgo muchilas’ i poxerila 😦 no u menja raznica expressii raz v 1000

  33. Анонімний:

    И это правильно. Вот при такой разнице можно верить QPCR

  34. Анонімний:

    Я не знаю как всю эту статистику считают, но я знаю, что при двух повторах по 1-2 р-ции на той же кДНК — это всё профанация. 🙂 Я помнимаю, что на 10 культурах, да по 20 таргетов, да при 5 референсах не шибко хочется повторять.
    Дело в том, что если кДНК не сажать и брать по 3-5 мкл на ПЦР, то эффективность выходит сильно отличающаяся от стандартов кои изготвлены из плазмид и т. п.
    Я много «экспериментировал» в этом плане и выяснил 🙂 что единственный достоверный способ убедиться в равной эффективности разных ПЦР это делать раститровки кДНК. Скажем, три последовательных разведения и каждое в дубле. 6 пробирок на таргет. 😦
    Ну и конечно, практически не возможно увидить разницу в 30-50%
    Считаю обоснованным обычное усереднение по нескольким экспериментам.
    Vlad

  35. Вопрос не в том, хочется или не хочется. Вопрос в том, что есть реальные финансовые лимиты и лимиты материала. Я провела большую серию пилотных экспериментов и пришла к выводу, что если кДНК делать аккуратно, то контроль во всех повторах показывает стабильные результаты: 24,38977 24,418273 24,750036 24,731224 24,409491 24,471037 24,30126 24,779504 24,49382438
    Кроме того, я сравниваю стадии развития одной ткани с шагом в два дня. Между двумя близлежащими стадиями нет и не может быть разницы в экспрессии генов большей, чем в 2 раза. Экспрессия меняется плавно. Например постадийно 29,12684491 27,87551706 27,0992972 26,6001584 25,90098901 25,74610014 Я, лично, отчетливо вижу профиль экпрессии.
    Или вот обратный профиль 16,84324709 17,89854062 19,1459743 20,68447836 21,16253163
    Более того, Это экспрессия факторов транскрипции. Они в основном в данной ткани в этой культуре экспрессируются довольно слабо. Есть три фактора, экспрессию которых можно зафиксировать на нозерне. Поэтому ПЦР был выбран как чувствительная альтернатива.

  36. Если разница в экспрессии в 1000 раз (я у себя подобную разницу в экспрессии только на запасных белках и видела), то вообще зачем ПЦРом ее мерять?

  37. kostia_inochkin распределение рабочих сил
    Русские для ДНК годятся. Напортачить там грязными руками сложновато, а сиквенсы праймеров для проверки можно индусу показать. Ну и опять же: русские произвели на свет нового мутанта! — это звучит гордо.
    Лаборантами японцев возьмем. Чтоб везде было чисто, и все приборы работали.
    С растениями должны работать прибалты, потому что растения растут медленно.

  38. Анонімний:

    Прошу пардону, я неудачно выразился.
    (и вообще я не писатель 🙂 )
    На счёт бюджета и прочих возможностей я всё понимаю.
    Касательно эффективности ПЦР, как краеугольного камня, много информации тут:
    http://www.gene-quantification.de/ в разделе „Determination of PCR Efficiency”
    Но всё это важно (особенно важно) если копийность (референс/таргет) сильно отличается. Если же отличие небольшое (2-4 цикла) то даже при сильно различающейся эффективности большая ошибка не набежит.
    Что же касается «разрешения» QPCR, то это легко проверяется. Берётся плазмида (стандарт) и раскапывается серия разведений, скажем так: х1.0; х1.25; х1.5; х1.75; х2.0 и проверяется. Желательно делать чётное число дублей 🙂
    Я проверял.
    Вот кстати, вы в белых плашках работаете? Белые сильно лучше прозрачных (на BioRad-е)
    Vlad

  39. Остановитесь, дайте паузу в месяц и разберитесь
    в теме- прокосультируйтесь со спецом (отличите его от не спеца).
    Пока это выглядит как бессмысленная потеря времени и реактивов.
    Коротко.
    ген А 22.5 22.3 reproducible? — вопрос бессмысленен.
    ген Б 20.3 20.1 reproducible? — вопрос бессмысленен.
    ген К 21.0 21.0 — не верю (ну вы там писали, что у вас несколько реперных генов)
    Эксперимент 2 (два повтора)
    ген А 24.1 24.3 reproducible? вопрос бессмысленен.
    ген Б 20.0 20.2 reproducible? вопрос бессмысленен.
    ген К 21.0 21.0 — не верю
    Ген А эксп1 vs эксп2 significant? Нет. Нужно не менее 5 повторов во 1 и 2 эксперименте. И чтобы все значения в первом были ниже любого значения во втором (если не так надо больше повторов). Поиграйте с подборками цифр типа 1, 2, 3, 4, 5 (1 экс) и 6, 7, 8, 9, 10 в Mann-whiney test.
    Ген Б эксп1 vs эксп2 significant? Разумеется, НЕТ! Сделав 10-20 повторов, может вытяните какой-нибудь эффект.
    Кстати, говоря, надо не только по пять повторов в эксп А2, но и хотя бы 5 повторов самого эксп.А2 В ТЕХ ЖЕ УСЛОВИЯХ. Или — упрощенная схема — 2-3 повтора в А2 и 5 повторов самого эксп.А2 В ТЕХ ЖЕ УСЛОВИЯХ.
    Еще советы.
    1. Лучше не говорить про «удвоение».
    2. Лучше забыть про (или начать серьезно разбираться в) CV, standard deviation, 95% CI, stabdard error of mean, intraassay variation, interassay variation.
    3. Лучше оставить надежды установить НАСКОЛЬКО больше А в А1 по сравнению с А2, если эта разница не в 100 раз минимум. Для этого нужна совсем иначе устроенная система генноинженерных внутренних контролей (ген А с встроенным фрагментом ВИЧ), внешних стандартных образцов и пр и др.
    4. Сосредоточтесь на вопросе: больше А в А2 по сравнению с А1 (это ведь ваш первый вопрос?)
    при всем уважении, больше писать некогда.

  40. Анонімний:

    Да мало ли чего…
    Может прибор есть и надо показать, что он используется. Ну и шоб по-модному было.
    Может с меткой нет возможности работать, а с DIG негативный экспириенс.
    Может объём образца ограничен…
    Может просто хочется попробовать.
    Vlad

  41. Re: Остановитесь, дайте паузу в месяц и разберитесь
    Мне каждое замечание сейчас на вес золота. Спасибо вам огромное. Пока я набираю информацию и пробую ее переварить. Я как раз только в CV, standard deviation, 95% CI, stabdard error of mean и разбираюсь ровно настолько, что могу с уверенностью сказать, что этот статистический метод мне категорически не подходит.
    Ок, я не спец и критически мыслю, но у меня перед глазами куча статей по микрочипам и уже qRT-PCR, где для построения профилей экпрессии вполне обходятся без железных пяти повторов. Из лаборатории, которая выпускает меньюал золотых правил qRT-PCR, выходят статьи с двумя повторами, которые я выше процитировала. Кое-где даже довольствуются одним, но мы легких путей не ищем. Я сравниваю профили экспрессии на протяжении развития у дикого типа и трансгена. И я вижу эту разницу. Более того, я верю, что она есть. Как мне ее продать?

  42. Да я этот сайт до дыр уже зачитала. И как калибровать я тоже знаю. Только я считаю не абсолютное количество темплейт, а относительную экпрессию. Мне надо убедительные доказательства, что контроль не меняется на протяжении развития. Это я могу и статистически убедительно доказать. А вот доказать, что различия в профиле экспрессии дикий тип vs. трансген, точно так же убедительно не получается.

  43. «1. расчитываю допустимую погрешность метода для контроля, который у меня на самом деле тоже вариирует (значение из примера ген К 21 это оптимальное значение, но на самом деле оно колеблется от 20,9 до 21,3), но контроль повторяется в большом количестве экспериментов и значений достаточно для надежной статистики).
    Допустим, что вариативность гена К не превышает 0.1% во всех экспериментах.»
    Это показывает только, что вы аккуратно работаете. Собственно, в этой ситуации ген К нужен вам для единственной цели. Если его СТ окажется 19 или 23 — выкиньте эксперимент совсем. Где-то сбой.
    «2. Исходя из этого заявляю, что если в двух повторах для гена А вариативность лежит за этими рамками, значит он не reproducible и фильтруется из дальнейших расчетов.»
    Это неправильно. Другой ген вощем-то может варьировать как ему вздумается.
    «считаю для двух измерений среднестатистическое и сравниваю средние значения для гена А в двух (на самом деле в пяти) экспериментах. »
    Это тот минимум, что я вам советовал выше.
    Точнее: эксперимент КАЖДОГО ТИПА надо повторять пять дней подряд с 2-3 повторами для каждого дня.
    «Если вижу разницу больше, чем в полтора раза, то считаю ее как significant.»
    Это неправильно (и никого не убедит). Примените Mann-Whitney test для двух НЕСВЯЗАННЫХ (важно!!) ВЫБОРОК (INDEPENDENT VARIABLES). p < 0.05 = статистически значимому различию.
    При этом вполне можно сравнивать 10 числе «в первом Типе эксперимента» против 10 чисел «во втором Типе эксперимента». Не надо усреднять повторы, полученные в один день.
    Если p в диапазоне от 0.05 до 0.2 показать статистическую значимость различия может помочь увеличение числа опытов.
    Если больше 0.2 — не стоит и стараться.
    Чуть правильнее ( и дает чуть больше надежд) на выявление стат. значимости сравнивать не сами СТ для А, а их дельту относительно соответстующего К (таким же образом).
    Но при той малой вариативности К, которую вы описали, мое предсказание — разницы в результате не будет.
    Да, ключевое слово — Непараметрические методы.

  44. Re: Остановитесь, дайте паузу в месяц и разберитесь
    1. Херни много и в «лаборатории, которая выпускает меньюал золотых правил qRT-PCR». Мы вощем такая лаборатория для экс-СССР.
    2. Задача ваша несложная и будь вы в москве, мы бы ее за день обсудили и решили. Но вы не в Москве, а свободного дня у меня раньше конца июня не видно.

  45. У меня начинает проясняться.
    Давайте вы еще бросите взгляд на реальные живые цифры эксперимента. Это без учета нормализации. Сырые даные.
    Дикий тип
    контрольный ген:
    день 1 23,9 23,2 день 2 23,3 23,7 день 3 23,4 23,3 день 4 23,3 23,9
    ген Х:
    день 1 20,7 19,9 день 2 22,8 23,3 день 3 25,2 25,4 день 4 27,3 27,9
    Трансген
    контрольный ген:
    день 1 23,6 24,2 день 2 23,8 24,7 день 3 24,1 24,1 день 4 24,3 24,0
    ген Х:
    день 1 21,1 21,7 день 2 25,2 25,6 день 3 27,6 27,8 день 4 29,0 29,0
    То есть я вижу а) профиль экпрессии. контольный ген не меняет экспрессию. ген Х плавно уменьшает количество продукта на протяжении развития. этот профиль повторятеся и у трансгена.
    б) я вижу, что у трансгена на каждой стадии развития продукта гена Х меньше, чем у дикого типа.
    Это так, или я выдаю желаемое за действительное?

  46. Re: Шоб мне не мучица
    яволь!

  47. Re: Шоб мне не мучица
    вместо запятых лучше точки — 21.1

  48. Re: Шоб мне не мучица
    может в екселе?

  49. Re: Шоб мне не мучица
    в нем родимом

  50. Re: Шоб мне не мучица
    как скажете. мне надо примерно полчаса, чтобы подготовить.

  51. Re: Шоб мне не мучица
    Нет проблем. Я уйду с работы через час-два.
    Сегодня могу не успеть ответить.
    тогда либо завтра, либо на выходных.

  52. Re: Шоб мне не мучица
    Ок! Огромное Вам спасибо!

  53. Да еще вопрос.
    В первый день (например)
    первый СТ контроля связан с первым СТ гена Х (типа одно выделение, реверсия, ПЦР в одной пробирке по разным каналам) — верно?
    А второй СТ контроля связан со вторым СТ гена Х, так?
    а вот
    В первый день (например)
    Первый СТ гена Х дикого как-то связан с Первым СТ гена Х трансгена (типа одно выделение, реверсия) ?
    А второй соответственно со вторым?
    Или их порядок условен? Что 21 и 22 для СТ гена Х дикого, что 22 и 21 для СТ гена Х дикого — одно и то же?

  54. Re: Да еще вопрос.
    Это все одно выделение, одна реверсия, одна ткань только разные дни развития и дикий тип с трансгеном.
    Более того, я сравнивала абсолютные значения контроля в другом выделении и даже на другом сорте и другом трансгене но на той же ткани. Так вот, он практически не меняется, такая я аккуратная 🙂 Я контроли долго и тщательно подбирала, потому что стандарные актины нам не подходят — зависят от развития.

  55. Re: Да еще вопрос.
    Понял. Но все же.
    День 1 измер1 Дикий = 22 Трансген = 23
    День 2 измер 2 Дикий = 23 Трансген = 24
    Это полностью эквивалентно
    День 1 измер1 Дикий = 23 Трансген = 23
    День 2 измер 2 Дикий = 22 Трансген = 24 ??
    Первое измерение дикого и трансгена в одной пробирке идет?
    А второе измерение дикого и трансгена в другой, соседней пробирке идет?
    Или Первое измерение дикого и трансгена в одном ПЦР прогоне в разных, соседних пробирках идет?
    А второе измерение дикого и трансгена одном, следующем ПЦР прогоне в разных, соседних пробирках идет?
    Или они УСЛОВНО пронумерованы как первое и второе?

  56. Re: Да еще вопрос.
    Поняла вопрос. все идет в разных пробирках и разные прогоны.
    Итак. Один прогон — это одна плашка приблизительно с 120 парами праймеров в отдельных ячейках. На всю плашку (в каждую ячейку) наношу один и тот самый темплейт кДНК из одного дня из одного растения. Другую кДНК на одну и ту же плашку не наношу.
    Следующий прогон — следующая кДНК из биологического повтора из того же дня с теми же праймерами. Следующий прогон — кДНК следующего дня. И так далее.

  57. Теперь дурацкий вопрос
    а дикий ген и трансген — ИЗ ОДНОГО растения?
    Просто измеряются разными праймерами?
    Или дикий и трансген из разных растений и попадают на разные плашки?

  58. Re: Теперь дурацкий вопрос
    Ой, я запутала с терминологией вероятно. Имеется в виду дикий тип и трансгенное растение, где я вырубила в помощью антисенса один регулирующий ген в этой ткани. Задача — сравнить как это повлияло на общую картину экспрессии факторов транскрипции и некоторых ключевых генов. Мы уже сравнили экспрессию с помощью биочипов. Но факторы транскрипции экспрессируются слабо, поэтому лежат ниже порога чувствительности биочипа.
    Я готова с таблицей и высылаю. Для чистоты эксперимента я вообще ничего не меняла, только выбросила значения, где ПЦР ничего не фиксировал. Это нефильтрованные данные и есть гены, которые не показывают никаких различий ни в профилях, ни в между трансгенным растением и диким типом.

  59. Re: Теперь дурацкий вопрос
    Выслала, только мой немецкий ексель ругается и не узнает точки вместо запятых. Я оставила запятые.

  60. Re: Теперь дурацкий вопрос
    Без проблем. минута работы. Кнопочку знать надо.
    но пока не получил.

  61. Re: Пока не получил.
    так. Я отправила еще раз с гмейла. Хотя на рабочую почту не вернулся. я поискала уведомление о прочтении и не нашла. Но я сейчас еще поищу.

  62. Теперь со всех получил.
    Почему контролей 4 штуки с разными СТ?
    Разное кол-во кДНК раскапывали?
    Генов много, вряд ли буду сразу все смотреть.
    Назовите пяток самых интересных и где есть подозрение на наличие эффекта.
    Ухожу, остальное потом.

  63. Re: Теперь со всех получил.
    контроли это разные гены с одинаковым названием. завтра пришлю фильтрованные

  64. 1a1:

    Есть сайт посвященный статистике в биологии и медицине — возможно там найдется полезная информация http://www.biometrica.tomsk.ru
    Судя по тексту вы фиксируете значения двухсот разных параметров,
    и проделав это дважды хотите сделать стат.обработку.
    Но если для каждого параметра сделано лишь 2 измерения, то какая же тут может быть статистика?

  65. Спасибо за сайт! Посмотрю. Я уже и так продвинулась, мне очень помогли ЖЖ френды. Зависит от метода. в некоторых случаях, особенно, используя биочипы, очень часто обходятся двумя повторами. При этом не столько считают достоверность, а фиксируют тенденцию.

Добавить комментарий

Заполните поля или щелкните по значку, чтобы оставить свой комментарий:

Логотип WordPress.com

Для комментария используется ваша учётная запись WordPress.com. Выход / Изменить )

Фотография Twitter

Для комментария используется ваша учётная запись Twitter. Выход / Изменить )

Фотография Facebook

Для комментария используется ваша учётная запись Facebook. Выход / Изменить )

Google+ photo

Для комментария используется ваша учётная запись Google+. Выход / Изменить )

Connecting to %s

%d такие блоггеры, как: