Лабораторные суеверия, мифы и факты про РНК.

Прошлый пост затронул любимую тему молекулярщиков — выделение РНК. Я тут собрала наши лабораторные мифы и суеверия об РНК.

Итак, 15 РНК фактов:

1. Перед тем, как приступить к выделению РНК, надо все реактивы и инструменты проавтоклавировать и охладить. Реактивы готовить на специальной воде, которая обработана ингибиторами ферментов (DEPC), которые разрушают РНК (РНКазы). Инструменты (ступки, пробирки, носики для пипеток) также обрабатываются этой водой с DEPC перед автоклавированием (стерилизацией). Поверхность стола обрабатывается ингибиторами РНКаз — DEPC. Если есть возможность, то носики-насадки на пипетки следует брать разовые, специально предварительно обработанные на заводе ингибиторами РНКаз. Материал растирать в жидком азоте, а последующие процедуры экстракции проводить на льду. Перед выделением РНК хорошо выспаться, сверить протокол с фазами луны и выгнать из лаборатории праздношатающихся. DEPC поставить на столе для отпугивания РНКаз.

2. Выделение РНК — едва ли не единственный экспериментальный процесс, где резиновые перчатки призваны не защитить руки экспериментатора от ядовитых реактивов, а скорее РНКу от рук экспериментатора (на руках есть РНКазы). На РНКу в процессе выделения не дышать (в зловонном дыхании есть РНКазы). И не смотреть (мало ли чего).

3. У каждого экспериментатора есть свой тайный протокол выделения РНК с прописями уникальных буферов. Протокол включает минимум 10 последовательных шагов экстракции разными реактивами, не считая очистки в хлориде лития и обработки ДНКазами. У меня таких протокола три.

4. Все-равно РНК обычно валится еще до того, как сделан последний шаг в выделении — растворение осадка. Шансы на успешное выделение РНК сильно падают, если записать протокол в лабораторный журнал до того, как РНКу окончательно выделить и померять на спектрофотометре.

5. Если придерживаться всех рекомендаций и делать все процедуры очень тщательно, то в одном из образцов обязательно окажется мелкая мушка. Это будет самый важный образец. Наличие мухи на результаты не повлияет.

6. Тем не менее существует копеечный набор реактивов для выделения РНК, который состоит из всего 3х растворов: буфер для экстракции, раствор для осаждения и буфер для разведения осадка РНКи. Все процедуры проводятся при комнатной температуре на грязном столе за один час.

7. Набор снят с производства в результате заговора империалистов. Состав реактивов не знает никто.

8. Опытным путем установлено, что РНК после выделения китом фирмы QUIAGEN показывает прекрасную очистку на фотометре, чудесное качество на контрольных форезах, но отвратительную афинность при гибридизации.

9. В то же время, грязная и некачественная РНК, выделенная тайным китом из трех реактивов, дает исключительный результат во всех дальнейших процедурах.

10. Существуют колонки для очистки и концентрации РНК, но ими категорически не рекомендуется пользоваться тем, у кого отсутствует чувство юмора, потому что у колонок отсутутвует опция остаточного объема и иногда вываливается мембрана. Есть и колонки с остаточным объемом и прочной мембраной, но они не подходят для стандартных пробирок от фирмы эппендорф, а пробирки, которые поставляются с колонками непригодны для автоклавирования, нестерильны и могут содержать РНКазы.

11. Я знаю человека, который выделяет РНК из пшеничной муки. Хорошую и качественную РНКу. Это лабораторный волшебник.

12. Я знаю человека, который выделяет РНК из отдельных клеток, причем количество РНК не фиксируется приборами. Тем не менее, он утверждает, что РНК в растворе присутствует. Это лабораторный шулер.

13. Я знаю лаборантку, которая выделяет всегда одинаковое количество хорошей РНКи из разных проб. При этом она не пользуется разовыми носиками для пипеток фабричной расфасовки. Это просто хорошая лаборантка.

14. Я знаю докторанта, который придерживается всех рекомендаций и ни разу не выделил хорошей РНКи. Причем я знаю много таких докторантов. Почти все докторанты такие. Они ходят со своими пробами к хорошей лаборантке.

15. Тем не менее, я люблю работать с РНК даже больше, чем с ДНК.

Реклама

56 Responses to Лабораторные суеверия, мифы и факты про РНК.

  1. не смотреть – во взглядє чілавєка содєржіцца невідімая нам енергія, до якої надзвичайно чутливі РНКази.

  2. Боже, какое счастье, что я не пошел в биологи! Я б удавился!

  3. я знаю одну молекулярщицю, яку хлібом не годуй, дай написати смішний пост, аби не виділят РНК.

  4. да! і про память води не забудь.

  5. Понимаю. Но есть плюс — видно конечный результат, хотя зачастую и бессмысленный.

  6. а пам’ять носіка і насадки?

  7. носіки на піпєткі це взагалі тема окремого фольклору

  8. Про докторов понравилось 🙂 У них вся сила на степень уходит, на собсно работу ничего не остается 🙂

  9. О да! Они способны менять свой жизненный график и время кофепития так, чтобы не пересекаться с коллегами. Таким образом они избегают главного вопроса: «Ну? Дописал уже диссер?».

  10. Где мои девятнадцать лет. У меня даже выделилось с первого раза! Больше не пробовала.

  11. У студентов всегда получается. Первый раз. Потом обычно перестает получаться.

  12. Надо будет написать подобный набор мифов по patch-clamp. Ты текст о нём переводила — думаю, можешь представить, какой там простор для фантазии.

  13. еще бы! представляю! у нас тут по любому методу эпическая мифология существует. Отдельная тема — клонирование генов. Там каждый шаг пронизан оккультными признаниями и шаманскими практиками.

  14. Замечательно.
    Именно все так.
    Я бы еще добавила, что после успешного (ура!) выделения РНК, ее (которая не нужна сейчас непосредственно в опыт) надо расфасовать по 1мкл и заморозить в кельвинаторе. При этом, когда придет нужда доставать аликвоты из кельвинатора — РНК будет содержаться в одной из 10 аликвот.

  15. Еще
    можно написать аналогичное произведение про приготовление образцов для масс-спектрометрии.
    Отклонения от правил и суеверий приводит к казусам, подобным описанному здесь: http://molbiol.ru/cb/01_01.html

  16. Re: Замечательно.
    Совершенно справделивое замечания. Есть еще тайное знание, что замораживание и размораживание РНК меняет концентрацию в растворе раз в 10.

  17. Re: Еще
    оййй, курящая свинья это шедевр! Днями приходит ко мне докторант и спрашивает: вот я выудил из нашей коллекции EST ячменя все аминокислотные транспортеры, второй день медитирую на последовательности. Скажи мне, если я вижу один транспортер, который не похож ни на один из растительных, зато похож на 100% на грибной, то может это быть контаминацией? Это еще что, говорю, я здорово переполошилась, когда в коллекции гороховых генов обнаружила вполне себе человеческий HIV-induced фактор.

  18. Re: Еще
    Я так понял, что гороху крупно не повезло в жизни 🙂

  19. Re: Еще
    Да уж не знаю, кто там руки не помыл. С мылом.

  20. Re: Еще
    А ЭТОТ текст Вы на Молбиол не положили?
    Ему там самое место…

  21. Re: Еще
    Для молбиол надо адаптировать: убрать уточнения, что такое ДЕПС и РНКазы.

  22. Re: Еще
    А я слышал, что HIV через рукопожатие не передается 🙂

  23. Re: Еще
    HIV через рукопожатие не передается, однако у нас тут человеческий HIV-induced фактор. Следствие. Может металлопротеиназа какая.

  24. Re: Еще
    Эх, заманилась я на лабораторные байки на молбиол. Там, оказывается, даже есть и мои древние. И вот попала на чей-то хит и сдохла: «В ответ на жалобы на полосы в отрицательном контроле при ПЦРе было услышано предложение помимо всяких контролей на буферы, буквы и др. поставить контроль без полимеразы.» Просто рыдаю.

  25. Не адаптировать, а наоборот —
    Адаптированные варианты обычно понимают как упрощенные для чайников. А тут нужно наоборот, перевести от чайников к специалистам.

  26. Re: Ну уж прямо!
    Ну так я и говорю, что надо убрать уточнения, а не дополнить. Поскольку все и так знают.

  27. а если серьезно — мне РНК в пятницу мерить (SAXS), точнее мое дело следить, чтоб бимлайн правильно работал, да данные обрабатывать, а мерить будет коллега-биолог. так она что-то никаких таких особых предосторожностей не предпринимает, носики берет из любой открытой коробки, пробирки в хатч заносит как попало. так как мерить я буду эти образцы далеко не первый раз (данные все время какие-то левые получаются), то у меня возникло подозрение, что что-то с РНКой идет наперекосяк.
    я, конечно, поспрашивал биологов, да и коллега эта должна лучше меня знать, но все же: для любой РНКи все так плохо? у нее какая-то синтетическая РНК, сделанная некой фирмой Noxxon, что-то я не заметил, чтобы она придиралась к носикам или пробиркам (чтоб не из открытого пакета).
    на что мне (не биологу) стоит обратить внимание?

  28. Я не берусь отсюда учить коллегу-биолога. Но суровая правда заключается не только в РНКазах. Даже в безРНКазной среде РНК валится при комнатной температуре, благодаря своей нестабильной химической структуре.
    Но! Я просмотрела Noxxon. Они занимаются какими-то зеркальными мерами, которые очевидно комплементарно схлопываются, образуя шпильки. Они утверждают, что их синтетическая РНК стабильнее. Однако это не исключает аккуратности и предосторожностей в работе с РНКой: стерильные носики, эппики и холод.

  29. да вот есть у меня такое подозрение, что наслушавшись баек про стабильность моя коллега (вообще разгильдяй по жизни) где-то что-то делает неправильно.
    схожу накануне в ветлаб, натырю нераспакованных носиков и эппиков.
    а холод — это сколько в градусах? у нас +10 обычно выставлено.

  30. Как это все жизненно :))) с РНКой не работала, но все равно смешно 🙂

  31. считается +4, а пробы носить на льду. но это зависит от того, для чего и как долго меряется. если быстро, то можно и теплее.

  32. принести на льду не проблема. мерить две минуты каждый образец (в растворе, под рентгеновским излучением), думаю, +10 переживет (при более низких температурах начинаются проблемы).
    спасибо за консультацию!

  33. Хорошо, что я этого не видела перед своим первым в жизни выделением РНК. 🙂 И так ручки дрожали, а зная все опасности, вообще б ничего путного не сделала. ;))

  34. *провыделяв РНКу последние 7 лет* да-да-да! Все именно так!
    Хотя и QIAдженовский кит, и тризол дают мне вполне симпатичные результаты, не надо гнать на каяджен, они хорошие, но дорогие сссс… волочи.
    У меня, кстати, вопрос про РНКу созрел. Коли такая пьянка, я его даже задам. Выделяла я тут из tissue culture, с тарелочки, тотал, китом. Обычно при разгоне на агарозе видно два пухлых бенда и тооооненький посередке. Я так понимаю, что пухлые есть рибозомальная РНК. А вот что в этом тооооненьком? Потому что в одном из семплов у меня высветились два тоооненьких и пухлый посередке. Муха на результат не повлияла, но я уже неделю думаю — кто это? 🙂

  35. !!! klass fazy luny i chustvo umora!
    Sogodni bula v labi pomityla novyj prikol—-raspylitel’ takyj yakym na kvity rospylyayut’ vodychku—-doverhu zapovnenyj RNase rozchyn-narod yak vydilyae rnku bruskae navkrug sebe vse sho bachyt’ i prohodyashih ludej))
    pro postdokov sho ne vmiyut’ rnku norm vydilyaty ce ne pro nas u nas i postdoki i assistanty vyilyayut’ prystojnu rnku vsi krim turka…a golovna nasha migera-kazala meni sho za svij vik vydidilyla bilsh nizh 5000 tyshsh sampliv i vsi majzhe chysti)
    krepki nervy togo hto pobachyt’yak vypadae membrna v sample)))chustvo umora pry comu mabut’ anglijske ))

  36. Re: !!! klass fazy luny i chustvo umora!
    Такі прискалки я також бачила. А про мембрану, яка випадає, краще не питай. Страшна історія. По-перше, кручу 24 зразки. Швидкість проходження зразків через колонку нерівномірна, щохвилини відкриваю центрифугу і перевіряю на око, щоб там залишилось 10 мкл. Якщо пропущу момент, то РНК чіпляється на мембрану — фіг елюіруєш. Коли залишається 10 мкл (там, де залишилось). перевертається колонка догори ногами, і центрифугується. І тут ця грьобана мембрана випадає. Я намагаюсь змити з неї залишки, але де там. Всьо в мусорнік. Тут не почуття гумору треба, тут треба залізні нерви. Одне виправдовувало ці мічєнія, що те, що почистилось, те чистилось дійсно добре.

  37. я что за tissue? вооще-то митохондриальная рибосомальная РНК с коэффициентом седиментации 24S. если растительная культура, то хлоропластная рибисомальная РНК визибл.

  38. А может я как раз напугать и хотела?!

  39. Надеюсь я отбила у тебя охоту

  40. не, человеческая, Jurkat & Panc1, подобный паттерн я наблюдала у BHK & HEK293 вот уже много лет, но раньше распределение бендов меня интересовало мало. Вот сижу и думаю: это у меня treatment такой (какой?) эффект вызвал или просто заскок случился.

  41. Добавляю факт номер 16: существуют объекты, из которых РНК выделяется только и исключительно набором фирмы Х, причем не просто, а исключительно после добавления в лизирующий буфер раствора Y.
    Стоит ли уточнять, что набор фирмы Х стоит тыщубаксов за 50 выделений, а раствор Y дешев, зато доходит до Москвы через три месяца после оплаты счёта…:(
    Вероятность того, что вам попадется такой объект, обратно пропорциональна количеству денег в лаборатории.

  42. Re: Еще
    Очень важный контроль — замена экспериментатора! (эх, кого бы убедить поставить за меня лигирование и трансформацию…)

  43. Re: Замечательно.
    А прогревать не пробовали 🙂 3 мин при 65 — и никаких изменений концентрации 🙂
    Могу кстати добавить еще один факт
    Из многих растений РНК выделяется только при помощи специальной жидкости Ambion «Plant RNA Isolation Aid» но тайного состава этой жидкости (кроме основного компонента — поливинилпирролидина)
    никто не знает. Сам ПВП аналогичным образом не действует.

  44. О, а ты уже написала:) А то я не дочитав до конца выше историю изложил 🙂

  45. Re: Замечательно.
    Кто ж её прогревать будет — все бояццо! Я тоже боюсь, кстати. Я даже расовую кДНК не прогреваю, хотя коллеги советовали.

  46. Re: !!! klass fazy luny i chustvo umora!
    uzhasy nashogo gorodka… da uzh…smix i grix…

  47. Может быть просто заскок. У нас в лабе как-то студент был, так он алкалийным лизисом так плазмиду выделял, что получал красивые суперсперализованные формы, прямо для учебника. Больше ни у кого так не получалось. Окзалось, что слишком тщательно лизировал и передерживал.

  48. Re: Еще
    Спокойно! У тебя все получится! Будешь еще байки про конструирование векторов писать!

  49. Re: Замечательно.
    ПВП у меня в тайном протоколе номер два. Я с ним растираю в азоте. Просто добавляю в сухом виде к материалу. Но вот тайные буфера кита Gentra (который перестали выпускать), для экстракции растительной РНК действительно волшебные. Самое интересное, что экстракция строго требует комнатной температуры. Все попытки усовершенствовать протокол и проводить реакции на холоде, успеха не имели.

  50. Напугала-напугала. Буду чаще перчатки менять. Сегодня вот как раз cDNA буду из замороженной РНК делать. 😉

  51. depc еще кто-то пользуется? во дают! мы салфеточками от рназов протираем стол и пипеторы. и все. а чтоб выделять как раз пользуемся колонками — никогда еще никаких мембран не вываливалось да и отдача отличная ))

Добавить комментарий

Заполните поля или щелкните по значку, чтобы оставить свой комментарий:

Логотип WordPress.com

Для комментария используется ваша учётная запись WordPress.com. Выход / Изменить )

Фотография Twitter

Для комментария используется ваша учётная запись Twitter. Выход / Изменить )

Фотография Facebook

Для комментария используется ваша учётная запись Facebook. Выход / Изменить )

Google+ photo

Для комментария используется ваша учётная запись Google+. Выход / Изменить )

Connecting to %s

%d такие блоггеры, как: